Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 11

Bài viết được trích từ tài liệu: “Nghiên cứu cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour., Solanaceae) làm thuốc chống viêm gan và ức chế xơ gan” của TS. Nguyễn Thị Bích Thu

Cagaileovn xin trích dẫn một phần luận án

Viêm gan, nhất là viêm gan do virus là căn bệnh khá phổ biến ở nhiều nước, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Viêm gan virus thường dẫn đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan.

Trong số khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) trên thế giới có khoảng 350 triệu người mang HBV mạn tính. Việt Nam nằm trong cùng có tỷ lệ nhiễm HBV cao. Vì vậy, nghiên cứu thuốc chữa bệnh gan là một trong những trọng tâm của nhiều nước trên thế giới, cũng như ở Việt Nam.

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 12

Nhân dân ta có nhiều kinh nghiệm quý báu, sử dụng nhiều loại cây làm thuốc chữa bệnh,…Tuy vậy cho tới nay nhiều loại cây thuốc chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, hoặc chưa được nghiên cứu một cách toàn diện và có hệ thống. Cà gai leo (Solanum procumbens Lour.), một cây thuốc mọc hoang dại trên nhiều vùng đất nước từ lâu đã được dùng để chữa các bệnh tê thấp, đau nhức xương, đau răng… là một trong nhiều cây thuốc chưa được nghiên cứu đầy đủ

Chúng tôi đã tiếng hành: “Nghiên cứu cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour., Solanaceae) làm thuốc chống viêm gan và ức chế xơ gan” nhằm các mục tiêu:

– Nghiên cứu xác định thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây cà gai leo theo hướng làm thuốc chữa bệnh gan, như chống viêm, bảo vệ gan, ức chế xơ gan và một số tác dụng khác

– Tạo ra thuốc mới từ cà gai leo có hiệu lực chữa bệnh, ứng dụng trong điều trị bệnh viêm gan mạn hoạt động

Khảo sát về nguyên liệu

Qua phân tích các đặc điểm hình thái cây ở một số địa phương, đối chiếu với khóa phân loại chi Solanum L. của G. Bonati, 1914 và trong “Thực vật chí Trung Quốc”, đặc điểm vi phẫu thân lá và bột thân lá cà gai leo, chúng tôi khẳng định những mẫu nguyên liệu nghiên cứu là Solanum procumbens Lour. ( hay Solanum hainanense Hance), họ Cà (Solanaceae).

Nghiên cứu hóa học

1/ Định tính các nhóm chất chính trong cà gai leo bằng phản ứng hóa học

Sơ bộ kết luận trong cà gai leo có alcaloid, glycoalcaloid, steroid saponin, flavonoid, coumarin, acid amin, phytosterol, chất béo, carotenoid, đường khử tự do.

2/ Kết quả định tính các chất bằng sắc kí lớp mỏng và sắc kí giấy

– Định tính sterol trong cà gai leo bằng sắc kí lớp mỏng thấy có hai vết, trong đó một vết có màu sắc và Rf tương tự beta-sitosterol, vết thứ hai không phải là diosgenin như các tài liệu trước công bố.

– Khảo sát nhóm alcaloid và glycoalcaloid: định tính bằng sắc kí lớp mỏng trên một số hệ dung môi cho thấy hệ IV (Cloroform : Metanol : Amoniac đặc (50 : 9 : 1) tách alcaloid và glycoalcaloid của cà gai leo tốt nhất.

Kết quả: dịch chiết alcaloid và glycoalcaloid toàn phần của cà gai leo cho ít nhất 4 vết màu vàng cam với thuốc thử Munier, trong đó vết (Rf = 0,22 ở hệ dung môi IV) có cùng màu sắc (phun thuốc thử Munier hoặc acid sulfuric) và Rf với solasonin ở cả 4 hệ dung môi khảo sát.

– Định tính aglycon: Thủy phân glycoalcaloid toàn phần trong dung dịch HCl 10%/cồn. Định tính aglycon bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi cloroform : methanol (9 : 1) cho thấy có 4 vết màu vàng cam với thuốc thử Munier và 5 vết với thuốc thử Vanilin/H3PO4.

– Định tính acid phenolic: bằng sắc kí lớp lớp mỏng và sắc kí giấy cho thấy phổ cho hai vết có cùng màu sắc và Rf với acid cafeic và acid chlorogenic.

Ngoài ra còn định tính coumarin, flavonoid, acid amin bằng sắc kí lớp mỏng và sắc kí giấy.

3/ Nghiên cứu phương pháp định lượng glycoalcaloid toàn phần trong cà gai leo và các chế phẩm bằng phương pháp acid màu.

– Qua khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng, đã xác định được điều kiện tối ưu của phương pháp là:

  • pH của dung dịch đêm là pH=8
  • Dung môi chiết là cloroform.
  • Nồng độ acid màu gấp 3-6 lần nồng độ solasodin.
  • Thời gian phản ứng tạo cặp ion khoảng 15 phút.

– Xác định hàm lượng glycoalcaloid trong cà gai leo ở một số địa phương bằng phương pháp acid – base và phương pháp acid màu.

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 13
Bảng 1 Hàm lượng glycoalcaloid trong cà gai leo 

Qua khảo sát hàm lượng glycoalcaloid trong cà gai leo thu hái ở một số địa phương khác nhau, sơ bộ đánh giá hàm lượng glycoalcaloid trong cà gai leo ở các vùng quanh Hà Nội, Thái Bình tương đối cao hơn ở Thanh Hóa.

– Hàm lượng glycoalcaloid trong các bộ phận khác nhau của cà gai leo: được xác định bằng phương pháp đo quang, cho thấy hàm lượng glycoalcaloid ở quả cao nhất (0,45%), sau đến lá (0,36%), rễ (0,2%) và thân (0,08%).

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 14
Bảng 2 Hàm lượng glycoalcaloid trong các bộ phận khác nhau của cà gai leo

4/ Chiết xuất và phân lập các chất trong cà gai leo

Phân lập solasonin từ glycoalcaloid toàn phần: Bằng phương pháp sắc kí cột với silicagel sắc kí cột của Merck; Rửa giải cột bằng hệ dung môi EtOAc – MeOH theo tỷ lệ khác nhau có độ phân cực tăng dần đã thu được một glycoalcaloid tinh khiết đặt tên là S1.

Kiểm tra độ tinh khiết của S1 bằng sắc kí lớp mỏng:

Hệ I : Cloroform – MeOH – NH3 (50:9:1)

Hệ II : EtOAc – MeOH (1:3)

Hệ III : BuOH – acid acetic – nước (4:1:5)

Kết quả: S1 luôn cho một vết trên bản mỏng sau khi khai triển bằng 3 hệ dung môi và phun hiện màu bằng 3 thuốc thử khác nhau. S1 là một đơn chất và sơ bộ kết luận là solasonin

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 15
Bảng 3 Các đặc điểm SKLM của S1 và solasonin

Nhận dạng S1: Qua các đặc điểm lý hóa của S1, phần genin và phần đường cấu tạo nên glycoalcaloid S1

  • Thể chất: kết tinh trong methanol, dạng hình kim nhỏ, không màu
  • Nhiệt độ nóng chảy: 298 – 301 độ C
  • Độ hòa tan: dễ ta trong ethanol, methanol, cloroform. Không tan trong ether và aceton

Thủy phân S1: bằng dung dịch HCl 10% trong cồn trên cách thủy hồi lưu trong 5 giờ. Dịch thủy phân sau khi kiềm hóa, chiết aglycon bằng cloroform. Bốc hơi dung môi thu được cắn màu trắng ngà (S2)

  • Kết tinh lại S2 trong methanol, được tinh thể hình kim màu trắng, tan tốt trong cloroform, n-Hexan; tan vừa phải trong methanol, ethanol.
  • Điểm chảy: 198 – 200 độ C

Sắc kí lớp mỏng aglycon S2 được khai triển ở 3 hệ dung môi và hiện màu bằng 3 thuốc thử khác nhau đều cho một vết  có màu sắc và Rf giống với màu sắc và Rf của solasodin.

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 16
Bảng 4 Các đặc điểm SKLM của S2 và solasodin

Hệ dung môi:

Hệ I: Cloroform – MeOH (9:1)

Hệ II: n-Hexan – ethyacetat (6:4)

Hệ III: Toluen – ethylacetat – aceton – acid formic (5:2:2:1)

Phổ hồng ngoại của S2 đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3350, 2930, 1650, 1460, 1380, 1180, 1030 (cm^-1), cho thấy S2 có các đỉnh đặc trưng giống solasodin chuẩn

Định tính đường thủy phân của S1 bằng SKG: dung dịch thủy phân của S1 sau khi được trung hòa và loại tạp, chấm lên giấy FN4, đồng thời chấm song song các dung dịch đường chuẩn là D-Glucose; L-Rhamnose; D-Galactose để so sánh

Sắc kí được khai triển trên 3 hệ dung môi khác nhau:

Hệ I: EtOAc – propanol – amoniac 1% – nước ( 35:25:2:3)

Hệ II: n-Butanol – acid acetic – nước (4:1:5)

Hệ III: EtOAc – acid formic – nước (8:1:1)

Hiện màu bằng thuốc thử anilin pbthalat.

Kết quả: sắc ký đồ cho 3 vết có màu sắc và Rf trùng với màu sắc và Rf của D-Glucose; L-Rhamnose; D-Galactose ở cả 3 hệ dung môi

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của S1:

Kết quả phân tích phổ 13C và 1H-NMR của S1 có so sánh với số liệu phổ của solasonin đã được công bố thể hiện ở bảng 5

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 17
Bảng 5 So sánh số liệu phổ 13C và phổ proton của S1 với solasonin

+ Phổ 13C-NMR: xác định được 27 tín hiệu trong phổ 13C-NMR của S2 (aglycon của S1) và 18 tín hiệu còn lại là do các nguyên tử C của đường. Đối với phần đường của S1, các tín hiệu cộng hưởng chính xuất hiện ở xicma 60-105 ppm ở phổ 13C và 3-5 ppm ở phổ 1H. Từ phổ 13C-NMR và phổ DEPT, có thể thấy rõ phân tử S1 có 45 pic phù hợp với 45 nguyên tử carbon trong phân tử, trong đó có 5 nhóm -CH3, 12 nhóm >CH2, 21 nhóm >CH-O, 3 nhóm -CH<, 3 nhóm >C< và 1 nhóm C-anomer.

+ Phổ 1H-NMR: Đã nhận biết và ghán phổ cho những vị trí quan trọng trong công thức của S1. Song do sự trùng lặp lớn và độ phân giải của máy thấp, nhất là ở vùng proton của đường và các nhóm -CH2- của khung aglycon nên không thể sắp xếp các tín hiệu cho toàn bộ proton. Tuy vậy, kết hợp với các số liệu khác cũng có thể kết luận được S1 là Solasonin.

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 18
Cấu trúc phân tử solasonin

Kết luận: Căn cứ vào tính chất của S1 như các đặc điểm SKLM, có so sánh với solasonin chuẩn, điểm chảy, các phổ 13C-NMR, 1H-NMR,IR của aglycon.. có thể kết luận chất S1 phân lập được cà gai leo là solasonin.

Kiểm tra độ tinh khiết của S3 thu được bằng SKLM

Tinh thể S3 được hòa tan trong một lượng vừa đủ methanol rồi chấm so sánh với acid cafeic chuẩn lên 3 bản mỏng đã tráng silica gel Merck và khai triển bằng 3 hệ dung môi khác nhau:

Hệ I: toluen – ethylacetat – acid formic (5:4:1)

Hệ II: ethyl acetat – acid forrmic (8:1)

Hệ III: ethylacetat – acid formic – nước (90:5:5)

S3 luôn cho một vết trên bản mỏng sau khi khai triển bằng 3 hệ dung môi khác nhau và nhận biết màu bằng 3 phương pháp khác nhau. S3 là một đơn chất và sơ bộ kết luận là acid cafeic.

Cà gai leo chống viêm gan, ức chế xơ gan Phần 1 19
Bảng 6 Các đặc điểm SKLM của S3 và acid cafeic

Nhận dạng S3 

  • Thể chất: tinh thể hình kim nhỏ, màu trắng ngà, kết tinh trong methanol
  • Điểm nóng chảy: 194-196 độ C
  • Độ hòa tan: dễ tan trong ethanol, methanol, nước, ethylacetat, ether. Dễ thăng hoa.
  • Phổ IR: Đo dưới dạng viên nén KBr có các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3419 (OH), 1646 (CO, liên hợp), 1449 (OH dao động biến dạng), 1297 (C-O) cm ^-1. So sánh phổ IR của chất S3 với thư viện phổ cho thấy phổ IR của S3 rất giống phổ của 3,4-dihydroxy cinamic acid.
  • Phổ UV-VIS của S3: có bước sóng cực đại (MeOH) : 218 và 325 nm
  • Phổ 13C-NMR của S3 cho thấy rõ phân tử có 9 pic phù hợp với 9 carbon trong phân tử acid cafeic
  • Phổ 1H-NMR: Căn cứ vào cường độ các pic và độ dịch chuyển hóa học có thể nhận ra 5 pic của 5 proton của 5 nhóm CH; trong đó, pic ở các vị trí C2,5,7,8 có độ dịch chuyển hóa học tương ứng là 7,03; 6,74; 7,42; 6,17 ppm (1H – vạch đôi), còn pic ở C6 có đ dịch chuyển hóa học là 6,95 ppm (1H- vạch đôi kép)

Kết luận: căn cứ vào các tính chất của chất S3 như đặc điểm SKLM, có so sánh với aicd cafeic chuẩn, điểm chảy, các phổ 13C-NMR, 1H-NMR,IR , UV-VIS … có thể kết luận chất S3 phân lập được cà gai leo là acid cafeic có công thức C9H8O4.

Bạn đọc có thể tìm hiểu thêm các nghiên cứu khoa học về cà gai leo tại Cagaleovn.com

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *